原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)（如大腸桿菌）具有快速、高產(chǎn)量、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠等優(yōu)勢，適用于大規(guī)模蛋白生產(chǎn)。

可以采用密碼子優(yōu)化、改變表達(dá)宿主菌株、調(diào)整表達(dá)條件（如溫度、培養(yǎng)基組分等）等方法來提高可溶性蛋白的表達(dá)水平。

在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，部分外源蛋白可能會由于錯誤折疊而形成包涵體，主要原因包括外源蛋白的復(fù)雜結(jié)構(gòu)或毒性。

1. 提高蛋白表達(dá)量：密碼子優(yōu)化可以顯著提高外源基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)量，為后續(xù)的分離純化等步驟提供便利。

2. 提高翻譯效率：通過減少稀有密碼子的使用，可以避免翻譯過程中的瓶頸，提高整體的翻譯效率。

3. 改善mRNA穩(wěn)定性：優(yōu)化后的mRNA二級結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，有利于核糖體的結(jié)合和翻譯過程的順利進(jìn)行。

為避免脫靶效應(yīng)，可以通過以下幾種方法：

   - 使用高特異性的Cas9變體。

   - 精確設(shè)計(jì)引導(dǎo)序列以盡量減少與非目標(biāo)序列的相似性。

   - 在設(shè)計(jì)sgRNA時使用生物信息學(xué)工具預(yù)測潛在的脫靶位點(diǎn)并進(jìn)行優(yōu)化。

通過對sgRNA進(jìn)行化學(xué)修飾（如在2'-OH位點(diǎn)進(jìn)行修飾）可以提高其穩(wěn)定性和活性。此外，優(yōu)化sgRNA的設(shè)計(jì)以減少脫靶效應(yīng)也有助于提高其效率。

特異性：確保siRNA序列特異性靶向目標(biāo)基因，避免脫靶效應(yīng)。

有效性：篩選具有高沉默效率的siRNA序列。

穩(wěn)定性：優(yōu)化siRNA序列以提高其在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性和有效性。

qPCR：定量檢測目標(biāo)基因mRNA水平的變化。

Western Blot：檢測目標(biāo)基因編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。

熒光顯微鏡：通過熒光標(biāo)記觀察siRNA或shRNA在細(xì)胞中的分布和表達(dá)。

選擇RNA聚合酶時，根據(jù)DNA模板上的啟動子序列選擇相應(yīng)的酶，如T7 RNA聚合酶適用于T7啟動子，T3 RNA聚合酶適用于T3啟動子，SP6 RNA聚合酶適用于SP6啟動子。

寡核苷酸應(yīng)保存在-20℃下，此條件下可穩(wěn)定保存一年以上。推薦以干燥形式存儲，因?yàn)檫@樣可以減少核酸酶導(dǎo)致的降解風(fēng)險(xiǎn)。

核苷修飾可以增加RNA的穩(wěn)定性、翻譯效率，并減少其在體內(nèi)引起的免疫反應(yīng)。

NGCodon^TM密碼子優(yōu)化技術(shù)是泓迅生物自主研發(fā)的技術(shù)，通過優(yōu)化RNA的密碼子使用，提高表達(dá)效率和穩(wěn)定性。